4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Спектрофотометрическое определение концентраций стрептодеказы в воздухе рабочей зоны

МУК 4.1.256-96

Минздрав России

Москва 2000

1. Методические указания по измерению концентрации вредных веществ в воздухе рабочей зоны (выпуск 30) разработаны с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций вредных веществ их предельно допустимым концентрациям (ПДК) и ориентировочно безопасным уровням воздействия (ОБУВ) - санитарно-гигиеническим нормативам и являются обязательными при осуществлении санитарного контроля.

2. Методические указания по измерению концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны утверждены и. о. Председателя Госкомсанэпиднадзора России - заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 8 июня 1996 г.

3. Введены впервые.

4. Включенные в данный выпуск 74 методики контроля вредных веществ в воздухе рабочей зоны разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.005-88 ССБТ "Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования", ГОСТа 12.1.016-79 ССБТ "Воздух рабочей зоны. Требования к методикам измерения концентраций вредных веществ" и ГОСТа Р 1.5-92 п. 7.3.

Методические указания одобрены на совместном заседании группы Главного эксперта Федеральной комиссии по санитарно-гигиеническому нормированию "Лабораторно-инструментальное дело и метрологическое обеспечение" и методбюро п/секции "Промышленно-санитарная химия" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены труда и профпатологии".

Ответственные исполнители: Г. А. Дьякова, C. И. Муравьева

Исполнители: Г. А. Дьякова, Н. С. Горячев. Л. Г. Макеева, Г. В. Муравьева, Е. М. Малинина, Е. В. Грыжина, Е. Н. Грицун.

УТВЕРЖДЕНО

И. о. Председателя Госкомсанэпиднадзора

России - заместителем Главного

государственного санитарного врача

Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

8 июня 1996 г.

МУК 4.1.256-96

Дата введения: с момента утверждения

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Спектрофотометрическое определение концентраций стрептодеказы в воздухе рабочей зоны

Стрептодеказа                                                                                     М.м. 70000-130000

п - 100 мол, % звеньев полиглюкина (ПГ); у - 24 мол. % окисленных звеньев ПГ; p - мол. % NH₂ - групп стрептокиназы, модифицированной ПГ.

Белый или с желтоватым оттенком лиофилизированный порошок или пористая масса, уплотненная в таблетку. Легко растворим в воде, растворе натрия хлорида 0,9 % изотонического (ГФ, х, стр. 756).

В воздухе находится в виде аэрозоля.

Проявляет сенсибилизирующие и аллергические свойства.

ПДК в воздухе - 1 мг/м³.

Характеристика метода

Методика основана на использовании высокоспецифических антител к стрептодеказе, проведении реакции антиген-антитело с антителами, меченными ферментом-маркером пероксидазой, и спектрофотометрическом тестировании активности пероксидазы при длине волны 492 нм.

Отбор проб проводят с концентрированном на фильтр.

Нижний предел измерения концентрации в анализируемом растворе - 0,03 мкг.

Диапазон изменяемых концентраций - от 0,12 до 1,2 мг/м³.

Нижний предел измерения в воздухе - 0,12 мг/м³ (при отборе 50 л воздуха).

Измерению не мешают белки (бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин), ферменты (липаза Pen. solitum, L - аспарагиназа Е. coli).

Суммарная погрешность не превышает ± 25 %.

Время выполнения измерений, включая отбор проб - 4 ч.

Приборы, аппаратура, посуда

Реактивы, растворы, материалы

Приготовление 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,2 ± 0,1. 35,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного растворяют в 1000 мл дистиллированной воды в мерной колбе, вместимостью 1000 мл.

4 г натрия фосфорнокислого однозамещенного растворяют в 250 мл воды в мерной колбе, вместимостью 250 мл.

1000 мл раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного и 250 мл раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного смешивают в стакане, вместимостью 2000 мл.

Раствор хранится в течение 2 месяцев в холодильнике.

Приготовление буфера "А". 1000 мл фосфатного буферного раствора рН 7,2 смешивают с 8,47 г хлористого натрия. Раствор хранят в холодильнике в течение 2 месяцев.

Твин-20 "Серва", ФРГ.

Приготовление буфера "В". К 1000 мл раствора фосфатного буфера рН 7,2 ± 0,1 прибавляют 29,2 г хлористого натрия и 1 мл твина-20. Раствор хранят в холодильнике в течение 2 месяцев.

Приготовление 0,1 моль/л фосфатно-цитратного буферного раствора рН 5,0 ± 0,1. В мерную колбу, вместимостью 1000 мл, вносят 7,3 г лимонной кислоты (моногидрат) и 9,47 г натрия фосфорнокислого однозамещенного безводного и доводят раствор до метки дистиллированной водой при перемешивании. Раствор хранят при температуре - 10 °С в течение 6 месяцев.

Приготовление 0,04 % раствора о-фенилендиамина. Навеску 10 г о-фенилендиамина растворяют в 24 мл фосфатноцитратного буфера в стакане, вместимостью 50 мл. Раствор готовят непосредственно перед измерением.

Приготовление раствора субстратной смеси. К 24 мл раствора о-фенилендиамина прибавляют дозатором, вместимостью 20 мкл, 14 мкл концентрированной перекиси водорода. Смесь готовят непосредственно перед измерениями.

Приготовление основного раствора стрептодеказы с концентрацией 0,6 мкг/мл. Точную навеску 25 мг (7,2 % белка) стрептодеказы растворяют в 6 мл дистиллированной воды. Массовая концентрация стрептодеказы в полученном растворе составляет 0,30 мг/мл. Из полученного раствора отбирают 1 мл дозатором на 1 мл и вносят в мерную колбу, вместимостью 500 мл. Объем доводят до метки дистиллированной водой.

Используют свежеприготовленный раствор.

Приготовление раствора стрептодеказы с концентрацией 0,12 мкг/мл. 5 мл основного раствора стрептодеказы пипеткой, вместимостью 5 мл, переносят в мерную колбу, вместимостью 25 мл. Объем доводят до метки буфером "А". Используют свежеприготовленный раствор.

Приготовление 4 М раствора серной кислоты. К 8,5 дистиллированной воды, используя пипетку, вместимостью 1 мл, добавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Раствор хранят при комнатной температуре.

Антисыворотка к стрептодеказе,

ВНИТИАФ

Приготовление раствора антисыворотки. Содержимое флакона с лиофилизированной антисывороткой к стрептодеказе растворяют в 5 мл буфера "В", используя пипетку, вместимостью 5 мл.

Далее из полученного раствора отбирают 0,5 мл дозатором на 1 мл и переносят в мерную колбу, вместимостью 500 мл, доводят объем до метки буфером "В". Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Подготовка сенсибилизированного планшета. Раствор стрептодеказы с концентрацией 0,12 мкг/мл заливают дозатором, вместимостью 0,2 мл по 0,2 мл во все лунки (кроме А1) полистиролового планшета для ИФА. Планшет закрывают крышкой и выдерживают 18 часов в холодильнике. Из лунок выливают раствор стрептодеказы и промывают 4 раза буфером "В" с помощью полуавтоматической промывалки.

Сенсибилизированный таким образом планшет используют в анализе или запаивают в полиэтиленовый мешок и хранят в холодильнике в течение 3 месяцев.

Антитела диагностические против

иммуноглобулинов кролика, меченные

пероксидазой, ВФС 42-8-ВС-85,

(антивидовой коньюгат)

Приготовление раствора антивидового конъюгата. Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 мл буфера "В", используя пипетку, вместимостью 10 мл. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Отбор пробы воздуха

Воздух с объемным расходом 10 л/мин аспирируют через фильтр АФА-ВП-20, закрепленный в фильтродержателе. Для измерения 1/2 ПДК достаточно отобрать 50л воздуха. Пробы хранят менее суток.

Подготовка к выполнению измерений

Градуировочный растворы готовят согласно таблице. Хранят в холодильнике не более 3 суток.

Таблица

Шкала градуировочных растворов

Проведение анализа

1. Во все промытые, не содержащие раствор лунки (кроме А1) предварительно сенсибилизированного планшета, заливают с помощью дозатора на 0,1 мл по 0,1 мл раствора антисыворотки, затем в лунки B1, C1 заливают по 0,1 мл буфера "В", в лунки 2-7 рядов А, В, С - по 0,1 мл градуировочных растворов. Для каждого стандартного раствора отводят по 3 лунки. Во всех лунках общий объем составляет 0,2 мл, лунка А1 остается пустой.

Планшет закрывают крышкой и инкубируют 1,5 ч при температуре 37 °С.

2. Выливают содержимое планшета и промывают его 4 раза буфером "В".

3. Во все лунки (кроме А1) вносят по 0,2 мл раствора антивидового конъюгата, закрывают планшет крышкой и инкубируют 1,5 ч при температуре 37 °С.

4. Четырехкратная промывка по п. 2.

5. Проведение ферментативной реакции.

В каждую лунку вносят дозатором на 0,1 мл по 0,1 мл раствора с субстратной смесью. Инкубируют по секундомеру 10 мин. Затем в той же последовательности в лунки вносят дозатором на 0,2 мл по 0,075 мл раствора 4М серной кислоты для остановки реакции.

6. Для измерения оптической плотности растворов в лунках планшет помещают в рамку считывателя АКИ.Ц.0,1. Измерение проводят при длине волны 492 нм, причем в качестве раствора сравнения используют раствор субстратной смеси в лунке А1.

Строят градуировочный график. На масштабно-координатной бумаге по оси абсцисс откладывают концентрацию стрептодеказы в градуировочных растворах в единицах концентрации (мкг/мл), а по оси ординат - значение оптической плотности при длине волны 492 нм. Градуировочный график строят одновременно с проведением измерений в пробах.

Проведение измерения

После отбора пробы воздуха фильтры АФА-ВП-20 помещают в стаканы, вместимостью 50 мл, и приливают 20 мл буфера "А", периодически встряхивая, выдерживают в течение 10 мин. Затем с помощью дозатора на 1 мл отбирают 1 мл раствора и переносят в мерную колбу, вместимостью 50 мл, объем доводят до метки буфером "В".

Анализ проводят аналогично процедуре при построении калибровочной зависимости.

Растворы могут храниться до проведения анализа в течение 2 суток в холодильнике.

По градуировочному графику на основании измерения значений оптической плотности в растворах проб определяют соответствующие концентрации стрептодеказы в пробах (мкг/мл).

Расчет концентрации

Концентрацию стрептодеказы (С) в воздухе (мг/м³) вычисляют по формуле:

, где

а - концентрация стрептодеказы в анализируемом растворе, мкг;

в - общий объем анализируемого раствора, мл;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, л (см. приложение 1).

К - коэффициент десорбции вещества с фильтра, равный 0,85.

Методические указания разработаны ВНИИТИАФ, г. С.Петербург.

Приложение 1

Приведение объема воздуха к стандартным условиям (температуре 20 °С и давление 760 мм рт. ст.)

Приведение объема воздуха к стандартным условиям проводят по формуле:

, где

V_t - объем воздуха, отобранного для анализа, л;

Р - барометрическое давление, мм рт. ст. (760 мм рт. ст. = 101,33 кПа);

t° - температура воздуха в месте отбора пробы, °С.

Для удобства расчета V_ст следует пользоваться таблицей коэффициентов (приложение 2). Для приведения объема воздуха к температуре 20 °С и давлению 760 мм рт. ст. (101,33 кПа) надо умножить V_t на соответствующий коэффициент.

Приложение 2

Коэффициент К для приведения объема воздуха к стандартным условиям